Points clés du fonctionnement d'un test ELISA

Des réactifs de haute qualité, une instrumentation performante et un fonctionnement correct sont essentiels pour obtenir des résultats précis et fiables. Les procédures ELISA varient selon le support en phase solide utilisé. Les tests ELISA sur plaque sont généralement utilisés pour les analyses médicales à domicile. Cet article décrit les points clés de chaque étape de la procédure ELISA sur plaque. Les tests ELISA sur billes, en tube et à billes magnétiques sont tous utilisés avec une instrumentation spécialisée. Des instructions détaillées sont fournies pour chaque type de test ELISA. Le strict respect de ces instructions garantit des résultats précis.

Collecte et conservation des échantillons

Un large éventail d'échantillons peut être utilisé pour les tests ELISA. Les fluides corporels (comme le sérum), les sécrétions (salive) et les excréments (comme l'urine et les selles) peuvent tous être utilisés pour doser des composants spécifiques d'anticorps ou d'antigènes. Certains échantillons peuvent être dosés directement (comme le sérum et l'urine), tandis que d'autres nécessitent un prétraitement (comme les selles et certaines sécrétions). La plupart des tests ELISA utilisent le sérum comme échantillon. À l'exception du fibrinogène et des anticoagulants, la composition du plasma est similaire à celle du sérum. Les échantillons de plasma nécessitent l'utilisation d'un anticoagulant, tandis que les échantillons de sérum peuvent être obtenus après coagulation naturelle du sérum et rétraction du caillot. Sauf circonstances particulières, le sérum est utilisé comme échantillon pour les analyses en laboratoire médical. Le plasma et le sérum peuvent être utilisés indifféremment dans les tests ELISA. Les échantillons de sérum peuvent être prélevés par des méthodes conventionnelles, mais il convient d'éviter l'hémolyse. La lyse des globules rouges libère des substances à activité peroxydase. Dans les tests ELISA marqués à la HRP, les échantillons hémolysés peuvent accroître le développement de colorations non spécifiques.

Les échantillons de sérum doivent être testés frais. Une contamination bactérienne peut entraîner la formation de HRP endogène, ce qui peut également produire des réactions faussement positives. Une conservation prolongée au réfrigérateur peut entraîner une polymérisation, ce qui peut augmenter le bruit de fond dans les tests ELISA indirects.

En général, les échantillons de sérum testés dans les 5 jours peuvent être conservés à 4 °C ; ceux testés sur plus d'une semaine doivent être conservés dans la glace. Après décongélation, le sérum congelé présentera une concentration locale en protéines et une distribution inégale. Mélanger soigneusement et délicatement pour éviter la formation de bulles d'air. Mélanger en retournant l'échantillon, mais éviter toute agitation vigoureuse au mixeur. Les échantillons de sérum troubles ou précipités doivent être centrifugés ou filtrés pour clarification avant analyse. Des congélations et décongélations répétées peuvent entraîner une baisse des titres d'anticorps. Par conséquent, si des échantillons de sérum destinés à des tests d'anticorps doivent être conservés pour plusieurs analyses, ils doivent être aliquotés et conservés sur glace. Le sérum doit être conservé aseptiquement dès son prélèvement et des conservateurs appropriés peuvent être ajoutés.

Préparation des réactifs

Préparer les réactifs nécessaires à l'expérience conformément aux instructions du kit. L'eau distillée ou déionisée utilisée pour l'ELISA, y compris celle utilisée pour le lavage, doit être fraîche et de haute qualité. Les tampons maison doivent être étalonnés à l'aide d'un pH-mètre. Les réactifs sortis du réfrigérateur doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation. Toute portion non utilisée du kit doit être rapidement remise au réfrigérateur.

Ajout d'échantillons

Un test ELISA comprend généralement trois étapes d'ajout d'échantillons : l'ajout de l'échantillon, l'ajout du conjugué enzymatique et l'ajout du substrat. Lors de l'ajout des échantillons, ceux-ci doivent être placés au fond des puits de la plaque ELISA, en évitant les parois supérieures. Veillez à ne pas éclabousser ni à créer de bulles.

Les échantillons sont généralement ajoutés à l'aide d'une micropipette, la quantité prescrite étant ajoutée aux puits. L'embout de la pipette doit être changé à chaque fois pour éviter toute contamination croisée. Des tubes en plastique jetables peuvent également être utilisés pour l'ajout d'échantillons. Pour les tests (tels que l'ELISA indirect) nécessitant du sérum dilué, diluez-le dans un tube à essai à la dilution prescrite avant d'ajouter l'échantillon. Vous pouvez également ajouter le diluant aux puits, puis ajouter l'échantillon de sérum, et agiter dans un micro-agitateur pendant 1 minute pour assurer le mélange. Pour ajouter la solution de conjugué enzymatique et la solution de substrat, une pipette multicanaux quantitative peut être utilisée pour accélérer le processus d'ajout.

Incubation
En ELISA, deux réactions antigène-anticorps se produisent généralement : après l'ajout de l'échantillon et après l'ajout du conjugué enzymatique. La réalisation de la réaction antigène-anticorps nécessite une température et une durée spécifiques. Ce processus d'incubation est appelé incubation. Certains l'appellent « incubation », ce qui semble inapproprié dans le contexte de l'ELISA.

L'ELISA est un immunoessai en phase solide, dans lequel la liaison antigène-anticorps se produit uniquement à la surface solide. Par exemple, dans la méthode sandwich avec revêtement d'anticorps, lorsqu'un échantillon est ajouté au puits d'une plaque, tous les antigènes présents n'ont pas la même chance de se lier à la phase solide. Seul l'antigène de la couche de solution la plus proche de la paroi du puits entre en contact direct avec l'anticorps. Il s'agit d'un processus d'équilibre progressif, nécessitant une diffusion pour atteindre le point final de la réaction. Il en va de même pour la liaison de l'anticorps marqué par l'enzyme ajouté ultérieurement à l'antigène en phase solide. C'est pourquoi les réactions ELISA nécessitent toujours un certain temps d'incubation.

Les températures d'incubation courantes sont 43 °C, 37 °C, la température ambiante et 4 °C (réfrigérateur). 37 °C est une température d'incubation couramment utilisée en laboratoire et constitue la température idéale pour la plupart des liaisons antigène-anticorps. Lors du développement de méthodes ELISA pour les études de cinétique de réaction, des expériences ont montré que la formation de produits atteint généralement son pic après une à deux heures à 37 °C pour deux réactions antigène-anticorps. Pour accélérer la réaction, la température peut être augmentée ; certaines expériences sont menées à 43 °C, mais des températures plus élevées sont déconseillées. Les réactions antigène-anticorps sont plus complètes à 4 °C. Dans les dosages radio-immunologiques, les réactions sont souvent réfrigérées toute la nuit pour maximiser la précipitation. Cependant, cette méthode n'est généralement pas utilisée en ELISA, car elle est trop longue.

Un bain-marie est généralement utilisé pour la conservation de la chaleur, sauf pour certains instruments ELISA équipés d'un bloc chauffant dédié. La plaque ELISA peut être placée dans un bain-marie, le fond de la plaque touchant la surface de l'eau, afin de permettre un équilibrage rapide de la température. Pour éviter l'évaporation, la plaque doit être recouverte. Les puits peuvent également être recouverts d'un film plastique, permettant à la plaque de flotter à la surface de l'eau. Si un incubateur est utilisé, la plaque ELISA doit être placée dans une chambre humidifiée en matériau thermoconducteur, comme le métal. Une gaze humide doit être placée au fond de la chambre, et la plaque doit être placée dessus. La chambre humidifiée doit être préchauffée à la température spécifiée dans l'incubateur, surtout par temps froid. Que l'incubation soit au bain-marie ou en chambre humidifiée, les plaques de réaction ne doivent pas être empilées afin d'assurer un équilibrage rapide de la température. Pour une incubation à température ambiante, la température de fonctionnement doit être strictement comprise dans la plage spécifiée. La température ambiante standard est de 20-25 °C, mais le fonctionnement spécifique peut être contrôlé conformément aux instructions du manuel. Pendant l'incubation à température ambiante, la plaque ELISA peut simplement être posée à plat sur la paillasse. Il convient de veiller à ce que la température et la durée d'incubation soient correctement spécifiées. Pour garantir cela, une personne ne doit pas tester plus de deux plaques à la fois.