Principes de base de la technologie de l'électrophorèse

La technologie de l'électrophorèse est basée sur les principes de base de l'électrophorèse et est affectée par les facteurs internes des particules électrophorétiques et les facteurs externes du champ électrique.
Principes de base

Dans des circonstances normales, les molécules matérielles n’ont généralement aucune charge, c’est-à-dire que la quantité de charges positives et négatives qu’elles portent est égale, ce qui montre leur neutralité électrique. Cependant, en raison de sa propre dissociation ou de l'adsorption d'autres particules chargées à sa surface, elle porte une charge négative ou positive et la substance migrera vers l'électrode positive ou négative dans le champ électrique. Il existe de nombreux types de particules matérielles chargées, qui peuvent être des ions ou des macromolécules biologiques, telles que des protéines, des acides nucléiques, des particules virales et même des organites.
Les molécules de protéines sont composées d'acides aminés, qui sont des électrolytes amphotères typiques et peuvent être dissociés en groupes aminés chargés positivement (-NH3+) et en groupes carboxyles chargés négativement (-COO-) en solution. La nature de la charge des molécules de protéines et la quantité de charge qu'elles portent dépendent principalement de leurs propriétés ainsi que de la force ionique (force ionique, I) et du pH de la solution.
Dans certaines conditions de pH, le nombre de charges positives et négatives des molécules de protéines est exactement égal et la charge nette des molécules de protéines est nulle. A ce moment, le pH de la solution est le point isoélectrique (pI) de la protéine.
Lorsque le pH de la solution = pI, les molécules protéiques ne sont pas chargées et ne bougent pas dans le champ électrique ;
Lorsque le pH de la solution > pI, les molécules de protéines sont chargées négativement et se dirigent vers l'électrode positive ;
Lorsque le pH de la solution < pI, les molécules de protéines sont chargées positivement et se dirigent vers l'électrode négative.

Les acides nucléiques sont similaires aux protéines et sont également des électrolytes amphotères. Les chaînes polynucléotidiques des molécules d'ADN et d'ARN ont à la fois des groupes phosphate acides et des bases alcalines, mais comme l'acidité du groupe phosphate est plus forte que l'alcalinité de la base, dans les solutions neutres ou alcalines, les molécules d'acide nucléique apparaissent généralement acides et portent des charges négatives. , et migrent vers l'électrode positive dans un champ électrique CC.

Facteurs qui influencent
Facteurs internes
La vitesse électrophorétique est liée aux caractéristiques des particules elles-mêmes, telles que la charge positive et négative, la taille et la forme des particules, la tendance à la dissociation, les propriétés amphotères, le degré d'hydratation, etc. charge qu'une particule porte, plus la particule est petite et plus la forme est proche d'une sphère, plus la particule se déplace rapidement dans le champ électrique ; sinon, plus il se déplace lentement.
D’une manière générale, les molécules d’ADN double brin linéaires n’ont pas de conformations complexes affectant la vitesse électrophorétique. En électrophorèse sur gel, le logarithme couramment utilisé de son poids moléculaire relatif est inversement proportionnel à la vitesse électrophorétique ; mais la vitesse électrophorétique de l'ADN plasmidique est grandement affectée par la conformation spatiale de la molécule. La vitesse relative de la vitesse électrophorétique de l'ADN plasmidique avec le même poids moléculaire est : type en boucle fermée > type linéaire > type en boucle semi-ouverte. Les molécules d'ARN sont des simples brins avec des structures locales en double hélice, de sorte que la vitesse électrophorétique des molécules d'ARN dépend non seulement de la taille de la molécule, mais aussi principalement de sa conformation spatiale.

Facteurs externes
1. Intensité du champ électrique Plus l'intensité du champ électrique est élevée, plus la force du champ électrique sur la particule chargée est grande et plus la vitesse de nage est rapide, et vice versa. Selon la différence d’intensité du champ électrique, l’électrophorèse peut être divisée en deux catégories :
① Électrophorèse à pression normale (2 ~ 10 V/cm) : la tension est généralement de 100 ~ 500 V. Adapté à la séparation de macromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques, le temps de séparation est relativement long, allant de plusieurs heures à plusieurs jours.

② Électrophorèse haute tension (50 ~ 200 V/cm) : la tension est généralement de 2 000 ~ 10 000 V. Il est principalement utilisé pour séparer de petites molécules, telles que des acides aminés, des peptides, des nucléotides, des sucres, etc. Le temps d'électrophorèse requis est très court, voire quelques minutes seulement.
2. Propriétés de la solution Incluent principalement le pH du tampon d'électrode et de la solution échantillon, la force ionique et la viscosité moyenne.
(1) pH de la solution : pendant l'électrophorèse, un tampon doit être utilisé comme solution d'électrode pour maintenir un pH de solution stable. Le pH de la solution détermine le degré de dissociation des particules chargées ; il détermine également le nombre de charges portées par la substance. Pour les électrolytes amphotères tels que les protéines, les acides aminés et les acides nucléiques, plus le pH du tampon est éloigné du pI de la substance à séparer, plus les particules portent de charge et plus la vitesse d'électrophorèse est rapide ; sinon, plus c'est lent. Par conséquent, choisir un pH approprié pour que le nombre de charges portées par les substances à séparer soit relativement différent est propice à leur séparation lors de l'électrophorèse. La plupart des électrophorèses de protéines utilisent des tampons barbituriques ou acide borique avec un pH de 8,2 à 8,8. A cette époque, les protéines sériques sont généralement chargées négativement.

L'électrophorèse des acides nucléiques utilise souvent l'un des trois systèmes tampons suivants : tampon TAE [acide tris-acétique-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)], tampon TBE (acide tris-borique) ou tampon TPE (acide tris-phosphorique). Les molécules d'ADN sont chargées négativement dans ces tampons.

(2) Force ionique de la solution : La force électrique nette générée par tous les types d’ions est appelée force ionique. Le niveau de force ionique dépend du nombre total de charges ioniques et n'a rien à voir avec leurs propriétés. Plus la force ionique de la solution est élevée, plus la vitesse de nage des particules chargées est lente ; à l’inverse, plus la vitesse de nage des particules chargées est rapide. La raison en est que les particules chargées attirent des ions de charges opposées pour se rassembler autour d’elles, formant une atmosphère ionique. L'atmosphère ionique réduit la charge des particules et augmente la résistance au mouvement des particules, réduisant ainsi la vitesse électrophorétique. De plus, si la force ionique est trop élevée, la chaleur générée lors du passage d’une grande quantité de courant peut provoquer l’évaporation d’une grande quantité d’eau. Cependant, si la force ionique est trop faible, la concentration totale et la capacité tampon de la solution tampon seront réduites, ce qui rendra difficile le maintien du pH de la solution, affectant ainsi la charge des particules, entraînant une diminution du courant, diffusion sévère et résolution électrophorétique réduite. Pendant l'électrophorèse, la force ionique de la solution est généralement de 0,02 à 0,20 mol/L.
(3) Viscosité de la solution : Comme mentionné précédemment, la mobilité électrophorétique des particules est inversement proportionnelle à la viscosité du milieu de la solution. Par conséquent, si la viscosité de la solution est trop faible ou trop élevée, cela affectera inévitablement la vitesse de l’électrophorèse.
3. Électrosmose Dans un champ électrique, le mouvement relatif d'une solution par rapport à un support solide est appelé électroosmose. Lorsque le milieu support n'est pas une substance absolument inerte, la solution proche du milieu support est souvent relativement chargée, et la solution se déplace en transportant les particules. Par conséquent, la vitesse de nage apparente d’une particule chargée est la somme vectorielle de la vitesse de nage de la particule elle-même et de la vitesse de nage de la particule transportée par la solution. Lorsque les deux directions sont cohérentes, la vitesse de nage de la particule est accélérée et lorsque les directions sont opposées, la vitesse de nage de la particule est réduite.
4. Adsorption La surface du milieu de support a un certain effet d'adsorption sur l'échantillon, qui peut retenir la substance à séparer et réduire la vitesse d'électrophorèse, provoquant ainsi une queue de l'échantillon et réduisant la résolution.

5. Chaleur Joule La chaleur générée par le passage du courant lors de l'électrophorèse est appelée chaleur Joule et sa valeur est proportionnelle au carré de l'intensité du courant. La chaleur Joule peut augmenter la température de la solution tampon, réduire la viscosité du milieu, intensifier le mouvement moléculaire et réduire la résolution. Lorsque la chaleur Joule est trop élevée, elle brûlera également le papier filtre, fera fondre le gel d'agarose ou brûlera le support du gel de polyacrylamide. L'influence de l'effet thermique sur l'électrophorèse peut être réduite en contrôlant la tension ou le courant, ou en installant un dispositif de refroidissement et de dissipation thermique.